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汉防己甲素对成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的影响

浏览数:495 

李万同 柳大烈 罗力生

摘要:

目的:探讨汉防己甲素预防和治疗增生性瘢痕的可行性。方法 对增生性瘢痕中的成纤维细胞进行培养,然后加入不同浓度的汉防己甲素,培养后继续观察成纤维细胞合成胶原蛋白的能力的变化。

结果:汉防己甲素可以抑制成纤维细胞合成胶原蛋白。

结论:汉防己甲素对成纤维细胞胶原蛋白的合成具有抑制作用,因此它可能对增生性瘢痕具有预防和治疗作用。

关键词:汉防己甲素;成纤维细胞;

增生性瘢痕增生性瘢痕的预防和治疗是困扰烧伤和整形界的一个难题,其主要病理特征是细胞外间质的过多沉积。这些细胞外间质是由成纤维细胞合成与分泌的。目前对于增生性瘢痕的药物治疗除激素外尚无其他有效的制剂,而激素有较多的副作用限制了它的临床应用。

有研究表明,汉防己甲素可以有效地治疗矽肺等纤维增生性疾病,李万同等的研究也表明它可以抑制成纤维细胞的增殖及活力。本组实验旨在观察汉防己甲素对体外培养的成纤维细胞胶原蛋白合成能力的影响,以探讨将其用于预防和治疗增生性瘢痕的可行性。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

汉防己甲素粉剂(纯度99.99%,浙江金华制药厂);DMEM培养基(美国GIBCO公司生产);小牛血清(杭州四季青生物制品研究所),细胞粘附仪(日本);鼠抗人Ⅰ型胶原蛋白抗体(1∶1200,SIGMA公司);兔抗鼠IgG(FITC标记,1∶10,SIGMA公司);粘附细胞仪(美国)。

1.2方法

将汉防己甲素溶解于DMEM培养基中,制成终浓度分别为1mg/L、10mg/L、100mg/L的含药培养液,过滤除菌后4℃保存备用。

2实验方法

2.1 成纤维细胞的培养  将手术中切取的烧伤后3~6个月形成的增生性瘢痕组织去除表皮及皮下组织,在无菌条件下剪碎,用含20%小牛血清的DMEM培养基在CO2孵箱中培养,实验选用3~10代的细胞。

2.2 检测成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白合成量

2.2.1原理 相对应的特异性抗体和抗原可以互相结合,由于抗体亦属于蛋白质而具有抗原性。因此可针对该抗体制备出另一相应的抗体,即第2抗体,并设法使该抗体与一荧光性物质结合,然后可以通过检测荧光强度来确定抗原的多少。本组实验采用的一抗为鼠抗人Ⅰ型胶原蛋白抗体;二抗为由可发出荧光的FITC标记的兔抗鼠IgG抗体,通过测量荧光强度即可间接反映Ⅰ型胶原蛋白的多少。

2.2.2方法 

①将18mm×18mm的盖玻片置于6孔培养板中,调整细胞悬液的浓度为5×105/ml,每个盖玻片滴3~4滴细胞悬液,以整个盖玻片均被覆盖且无外溢为宜,培养8小时后成纤维细胞贴壁,再加入含血清的培养液培养48小时;

②更换为条件培养液,对照组加入不含血清的培养液,继续培养24小时;

③去除培养液,用PBS液冲洗3次,每次3分钟,用1∶20的羊血清封闭非特异性抗体;

④用PBS冲洗,然后加1∶1200的鼠抗人Ⅰ型胶原蛋白抗体40μl,将培养板四周缝隙用胶布密封,置入4℃冰箱中24小时;

⑤用PBS冲洗3次。加1∶10兔抗鼠FITC标记的IgG抗体50μl,密封后置于4℃冰箱中保存4小时,PBS冲洗;

⑥用粘附细胞仪逐个测定其荧光强度。

1 汉防己甲素1mg/L(10×20)图2 汉防己甲素10mg/L(10×20)

3 汉防己甲素100mg/L(10×20)图4 对照组(10×20)

3结果

在荧光显微镜下观察,发现经汉防己甲素处理过的成纤维细胞荧光强度减弱,并随汉防己甲素浓度的增加,荧光强度减低明显(图1~4)。通过计算机测量分析,可以看出相互之间荧光强度的差别有统计学意义(表1)。

1 汉防己甲素对瘢痕成纤维细胞胶原蛋白合成的影响

4讨论

汉防己甲素是从千斤藤属植物粉防己的根块中提取的一种生物碱,它具有广泛的生物学作用,可以降低血压,拮抗心率失常,同时抑制血小板和多形核白细胞合成血栓素,还可以拮抗钙离子对兔主动脉的收缩作用。

它能与硫氮卓酮竞争苯噻氮卓受体,是钙调蛋白的拮抗剂。何凤慈等的研究表明汉防己甲素可以抑制中性粒细胞游走,提高细胞内超氧化物歧化酶的活性,清除或抑制氧自由基的生成,并使cAMP的水平显著升高。国内于20世纪80年代中期开始使用汉防己甲素治疗硅尘所致的矽肺,并取得良好效果,研究表明它可以抑制肺中Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白表达,从而减轻了肺的纤维化,并使疾病发生逆转。

本实验表明,汉防己甲素在较低浓度的作用下即可抑制瘢痕成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白。我们认为其抑制胶原蛋白合成的机制可能与其钙离子通道阻滞作用有关。因为钙离子在细胞的各项功能活动中都起着重要作用,尤其是细胞的胞吐与排泌作用,这一过程是钙离子依赖性的。当钙离子的移动受到阻滞时,细胞向外排泌前胶原蛋白的活动即停止或减弱,使已合成的前胶原蛋白积聚在粗面内质网及高尔基氏体内,并反馈抑制前胶原蛋白的进一步合成。

另外还有研究表明一些钙离子通道阻滞剂可以直接抑制脯氨酸掺入胶原蛋白中而抑制胶原蛋白的合成。至于是否还有其它作用机制,尚有待于进一步研究。

在增生性瘢痕中,细胞间质主要是由成纤维细胞合成和排泌的,而在这些细胞间质中Ⅰ型胶原蛋白又是主要成分,因此汉防己甲素对成纤维细胞的这种作用表明它可能对增生性瘢痕的预防及治疗具有一定的作用。

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