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粉防己与其主要组分粉防己碱效、毒作用及关系初探

浏览数:75 

梁琦,闫润红,王永辉,张瑾,薛晓娜,李艳彦

(山西中医学院,太原030024)

目的:结合粉防己碱在生药及水提物中含量的测定,从效、毒两个维度来阐释粉防己与其主要生物碱粉防己碱的作用差异及两者之间的关系。

方法:HPLC测定粉防己水提物中粉防己碱的含量的基础上,确定粉防己碱给药剂量,分别采用热板法、小鼠耳肿胀法对粉防己与粉防己碱的镇痛、抗炎作用进行比较研究:同时,选取给药12,24以及停药123个不同时间点实验动物总蛋白(TP),白蛋白(ALB),丙氨酸氨基转氨酶(ALT),天冬氨酸氨基转氨酶(AST),总胆红素(TBIL)作为观测指标,对粉防己与粉防己碱的肝脏毒性进行探查和比较。

结果:

①防己药材中粉防己碱的含量8.99mg/g,粉防己水提液中粉防己碱的转移率为30.03%:

粉防己与粉防己碱均有明显的镇痛作用,但从短期镇痛效果而言,以粉防己碱为佳,从长期镇痛效果而言,以粉防己水提物为佳。粉防己碱的抗炎效果相对优于粉防己水提物的抗炎效果,但两者相比无显著性差异。

③粉防己水提物和粉防己碱给药均可以造成一定程度的肝细胞受损,但两者的作用机制不同,且粉防己水提物造成的肝脏损伤停药后具有可逆性,而粉防己碱造成的肝脏损伤在停药后则继续发展。

结论:粉防己碱作为粉防己的主要组分,并不能够完全表征粉防己的药效及毒性,同样的,粉防己中的其他组分也对粉防己碱的毒性作用没有明显的监制作用。粉防己碱与粉防己的效、毒作用表现及机制并不相同。

近年来,粉防己作为广防己替代品的安全性正受到质疑,有关粉防己的效-毒研究逐渐开展。目前已有研究发现,粉防己存在着明显的肝、肾毒性,以肝毒性出现时间早,症状表现严重。而粉防己碱作为粉防己的主要生物碱,其研究多集中在药理作用方面,仅有少数对粉防己碱毒性研究的报道。粉防己碱的毒性及毒性作用与其所含的主要生物碱—粉防己碱之间存在着怎样的关系,均有待进一步研究。

本课题组在探查粉防己碱在生药及水提物中不同含量基础上,通过对粉防己及其主要组分粉防己碱效、毒关系的探查,从效、毒2个维度来阐释粉防己与其主要生物碱-粉防己碱的作用差异及二者之间的关系。为临床合理使用粉防己及其主要生物碱提供参考,为认识某一成分与以此成分为主要化学基础中药的毒性关系提供一定理解,为全面认识中药毒性提供安全性评价依据。

1材料

1.1动物SD大鼠90只,SPF级,雄性,体重(130±10)g,购自山西医科大学实验动物中心。昆明种小鼠70只,SPF级,雌性,体重(25±5)g,购自山西医科大学实验动物中心。

1.2药材粉防己药材购自北京同仁堂山西有限公司,经山西中医学院裴香萍副教授鉴定为防己科植物粉防己Stephanaiatetrandra的根,HPLC法测得粉防己碱含量为8.99mg/g,药材合格。

粉防己碱购自南京泽朗医药科技有限公司(批号110711-200708)。

粉防己水提物,取粉防己药材1000g置提取罐中,加相当于药材10倍体积的冷水浸泡1h,加热至沸腾,煎煮1h,倾出药液,残渣加入9倍体积的水,煎煮1h,合并2次药液,过滤,减压浓缩至1235ml药液,浓缩液和药材之比为1.23∶1(相当于1ml含生药0.81g),4℃冷藏备用。HPLC法测得粉防己碱含量为2.78mg/g。也就是说,每毫升粉防己碱水提物中含有粉防己碱2.25mg。

粉防己碱水提物,用时用蒸馏水配置成混悬剂,质量浓度为2.252g/L

2方法

2.1分组及处理健康雄性SD大鼠90只,适应性饲养1周后,按体重随机分为正常组、粉防己组、粉防己碱组,每组30只,共3组。粉防己组按每天8.1g/kg(10倍2010年版《中国药典》剂量)ig给药(含粉防己碱22.52mg/kg),粉防己碱组按每天22.52mg/kgig给药。分别于给药的第12,24天以及停药观察12后,从各组中随机取大鼠10只,动物称重后处杀,取血液及肝脏组织。

经热板仪选择痛阈值在5~30s的小鼠30只,按体重随机分为空白组、粉防己水提物组、粉防己碱组共3组,每组10只。粉防己组按每天11.7g/kg(10倍2010年版《中国药典》剂量)ig给药(含粉防己碱32.53mg/kg),粉防己碱组按每天32.53mg/kgig给药。

镇痛实验采用热板法:抗炎实验采用小鼠耳廓肿法(二甲苯致炎,每只涂抹0.02mL)。

2.2观察指标血生化检测,丙氨酸氨基转氨酶(ALT),天冬氨酸氨基转氨酶(AST),总蛋白(TP),白蛋白(ALB),总胆红素(TBIL):测定给药后不同时间点痛阈值,取炎症标本,计算肿胀度。

2.3标本采集与制备

2.3.1血浆制备2mL全血4℃放置50min,2500r/min离心8min,取血清500μL,供TP,ALB,ALT,AST,TBIL检测。

2.3.2痛阈值测定每组在ig给药后30,60,90,120min各测定痛阈值1次,并记录痛阈值。对60s内不舔后足的小鼠应立即取出来,痛阈按60s计算。以免造成小鼠损伤。

2.3.3肿胀度测定各组给药后,沿耳廓基线剪下两耳,用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片,分析天平称重,并计算肿胀度。

2.4统计学处理数据用SPSS13.0统计软件处理,所得数据均以x(_)±s表示,多样本之间的组间比较采用单因素方差分析检验,非正态分布资料用非参数统计分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

3结果

3.1粉防己和粉防己碱热板法镇痛效果粉防己水提物组小鼠在给药后的各个时间点痛阈值均明显升高,且在给药后30,90,120min时与空白组相比均有显著性差异(P<0.05):粉防己碱组小鼠在给药30min后出现明显的镇痛作用,与空白组相比有显著性差异(P<0.05):与粉防己碱组相比,粉防己水提物组小鼠在给药后60,120min时的痛阈值均明显升高(P<0.05)。

见表1。

3.2粉防己和粉防己碱小鼠耳肿胀法抗炎效果

粉防己水提物、粉防己碱均有明显的抗炎作用,与空白组相比,均有显著性差异(P<0.05)粉防己水提物、粉防己碱相比,以粉防己碱抗炎效果明显,但无显著性差异。

见表2。

3.3粉防己碱及粉防己大鼠ALT,AST,TP,ALB,TBIL的动态变化粉防己水提物组大鼠在整个给药期间,ALT呈现先上升后下降,停药后又上升的趋势,但与正常组相比,各个时间点均无显著性差异:粉防己碱组大鼠在整个给药期间,血浆ALT呈现先下降后上升,停药后仍呈不断上升趋势,且在停药恢复12d时与正常组相比,ALT明显升高,有显著性差异(P<0.05)。

见表3。

粉防己水提物、粉防己碱对大鼠AST呈现不断下降的趋势,且与正常组相比差异显著(P<0.05, P<0.01),停药恢复12d后有所上升,且与正常组相比,无显著性差异:粉防己碱组大鼠在整个给药期间,血浆AST含量呈现先下降后上升,停药后仍呈不断上升趋势,在给药12与停药恢复12后与正常组相比均有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。见表3。

粉防己水提物、粉防己碱对大鼠TP,ALB,TBIL含量均无明显影响,与正常组相比无显著性差异:粉防己水提物与粉防己碱对大鼠血浆TP,ALB,TBIL含量影响也无显著性差异。见表3。

4讨论

4,1药效学研究结果有关粉防己的药理学作用研究不多,部分研究主要是围绕其利尿作用展开的,仅有研究发现粉防己按11.70g/kg灌胃给药,具有明显的镇痛作用:按8.10g/kg灌胃给药,对蛋清致炎各时间点的足肿胀以及棉球肉芽致炎后期的肉芽增生则无明显影响。粉防己碱的药理作用研究非常丰富,具有明显的抗炎、镇痛、对抗心、脑、肾缺血,抗纤维化,抗肿瘤多药耐药性,降低门静脉高压等多方面的作用。但未见粉防己与粉防己碱药理作用对比的研究。

本研究从短期镇痛效果而言,以粉防己碱为佳,从长期镇痛效果而言,以粉防己水提物为佳。推测粉防己碱可能为粉防己的主要镇痛组分,故在给药后很快即可出现明显的镇痛效果,但粉防己中的其他组分,如防己诺林碱、去甲汉防己碱、汉防己丙素、轮环藤粉碱以及黄酮苷、酚类、有机酸、挥发油等物质可能对粉防己碱的镇痛效果起了协同和持续的作用。

粉防己水提物与粉防己碱均对小鼠耳肿胀有明显的抑制作用。虽然二者相比无显著性差异,但可见

粉防己碱的抗炎作用要优于粉防己水提物对炎症的抑制作用。

4,2肝脏毒理学研究结果ALT,AST是肝功能检查的重要指标。粉防己水提物可以造成大鼠ALT和AST下降,以对AST影响更为严重,随着给药时间延长,下降幅度更加明显,但停药后明显恢复。提示,粉防己水提物给药可以造成一定程度的肝细胞受损,但停药后,损伤存在可逆性。

粉防己碱可以在给药初期,造成大鼠ALT和AST下降,以对AST影响更为严重,随着给药时间的延长,使ALT和AST活性升高,随着给药时间延长,升高幅度更加明显,且停药后无法恢复。提示,粉防己碱给药可以造成一定程度的肝细胞受损,且停药后,损伤不可逆。

粉防己碱和粉防己水提物均可以造成动物肝脏损害,为现有的粉防己及其生物碱的肝毒性研究增加了新的证据。

特别需要强调的是:①本研究中发现粉防己和粉防己碱在给药期间的不同时间造成了不同程度的ALT和AST下降,与传统认为的ALT和AST升高才提示肝功能异常正好相反,但在现有的报道中也发现粉防己按8.1g/kg灌胃给药在给药2周时出现ALT下降,虽然没有统计学差异,但也提示粉防己及其主要生物碱造成的肝脏损伤早期可能以肝酶的降低为主。目前有研究显示代谢性的原因可能是导致ALT和AST下降的主要原因。但具体的机制需要进一步探查。②粉防己水提物和粉防己碱对肝脏造成损伤的机制并不一致,但无论是粉防己水提物还是粉防己碱对AST的影响均大于ALT,提示其对肝脏的影响与线粒体的关系非常密切。目前也有报道显示,粉防己碱对肝功能的损伤可能与线粒体途径有密切关系。

综合药理、毒理研究结果分析,可见粉防己水提物与粉防己碱在药效及毒理学研究方面均不存在明

显的一致性,粉防己中的其他成分对粉防己碱并不具备明显的增效或者减毒作用。也就是说,粉防己碱虽然是粉防己的主要组分,但与粉防己的效、毒作用机制并不相同。粉防己碱作为粉防己的主要组分并不能够完全表征粉防己的药效,同样的,粉防己中的其他组分也对粉防己碱的毒性作用没有明显的监制作用。但不容忽视的是,粉防己停药后存在着粉防己碱停药后不具备的肝脏毒性可逆性。

参考文献:略

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