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粉防己碱的抗炎作用与炎症白细胞2M的关系

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张乐之何华美李新芳吕金胜黄钺华

目的:研究粉防己碱(tetrandrine,Tet)的抗炎作用与炎症白细胞cAMP的关系。

方法:在大鼠胸膜腔内注射角叉菜胶(10mg/kg)复制胸膜炎,并于致炎前30min腹腔注射Tet。用常规方法测量胸膜腔渗出液量,用试管稀释法计数渗出液中白细胞数,用放射免疫分析法、间接法、酶放射化学分析法和荧光比色法,分别测定炎症白细胞cAMP浓度、腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)活性及胞质内游离钙浓度[Ca2+];体外观察细胞外钙对Tet调节炎症白细胞PDE活性的作用。

结果:Tet(10~80mg/kg)腹腔注射,剂量依赖地降低胸膜腔渗出液量和白细胞游出数,同时增加白细胞cAMP浓度;Tet亦剂量依赖地降低炎症白细胞PDE活性及[Ca2+],但对白细胞AC活性无明显影响。Tet抑制炎症渗出的作用与其增加白细胞cAMP浓度的作用呈线性相关;其增加白细胞cAMP浓度的作用则与其抑制PDE活性呈线性相关;后者与其降低[Ca2+]呈线性相关。在体外,Tet抑制细胞外Ca2+和A23187引起的PDE活性升高,其抑制作用可因细胞外钙浓度增加而逆转。

结论:增加炎症白细胞cAMP浓度可能是Tet重要的抗炎作用机制之一;Tet主要通过降低炎症白细胞[Ca2+]从而抑制PDE活性并最终减少cAMP降解,Tet对AC活性无明显影响。

关键词:粉防己碱;炎症;嗜中性白细胞;环腺苷一磷酸;腺苷酸环化酶;磷酸二酯酶;钙

粉防己碱(tetrandrine,Tet)是从中药防己科植物粉防己根中提取的生物碱,为双苄基异喹啉衍生物。Tet对大鼠巴豆油性肉芽肿、佐剂性关节炎、角叉菜胶性胸膜炎等急慢性实验性炎症有明显的抑制作用。但其抗炎作用机制尚未完全阐明。cAMP以及提高细胞内cAMP水平的物质,能够抑制炎症细胞释放组胺、溶酶体酶、氧自由基和某些炎症介质,将cAMP通过各种途径(灌胃、腹腔或皮下注射)给予动物,也能有效地抑制外源性组胺和角叉菜胶所致的血管通透性增高以及内源性组胺释放。本文采用角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型,探讨Tet的抗炎症渗出作用与炎症白细胞cAMP的关系,并进一步分析Tet调节cAMP的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品,Tet由浙江金华制药厂生产(粉剂,批号:921206);角叉菜胶(carrageenan,Car)、蛇毒、腺苷、茶碱、2,5二甲基噁唑(PPO)、1,4-双(5-苯基噁唑-2)苯(POPOP)、Triton、ATP、DDT、Fura-2和Fura-2/AM均为美国Sigma公司产品;QAE-sephadex A-25购自Pharmacia公司;[3H]-cAMP2.22TBq/mmol)购自美国Dupont公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 动物:♂Wistar大鼠(180±36)g,60只(本校实验动物中心提供,渝医实动字310101015号),随机分为生理盐水(NS)对照组(10只),Car致炎组(18只)和Tet 10、20、40、80mg/kg处理组(每组8只)。经乙醚轻度麻醉后,Car致炎组和Tet处理组大鼠向右胸膜腔内注入0.5%Car2ml/kg,NS对照组大鼠注入等容量NS。

1.3 给药方法 处理组大鼠分别于致炎前30min腹腔注射Tet 10、20、40、80mg/kg(5ml/kg,用5%葡萄糖盐水配制);NS对照组和Car致炎组腹腔注射等容量5%葡萄糖盐水。

1.4 白细胞悬液的制备:各组大鼠于致炎后8h,脱颈处死,立即打开胸膜腔,用已硅化的玻璃吸管吸出胸膜腔内的全部渗出液,盛于已硅化的刻度离心管内,置冰浴中,常规测量渗液量,试管稀释法计数白细胞,然后参照文献制备5×10-9/L白细胞悬液,备用。

1.5 cAMP含量测定:将各组白细胞悬液用HBSS稀释成1×10-9/L,再用沸水变性法提取cAMP,然后用放射免疫分析法测定cAMP含量。

1.6腺苷酸环化酶(AC)活性测定,参照间接法并加以改进。取各组白细胞悬液,于冰浴下超声破碎(60W,20s×6,间隔20s)后,4℃,1800×g离心8min,取上清液100μl,加入反应液(含氯化镁4mmol/L,茶碱5mmol/L,ATP和DDT各2mmol/L)400μl。于37℃孵育20min后置沸水中灭活3min以终止反应冷却后1800×g离心15min,取上清液经真空干燥后,按放射免疫分析法测定cAMP含量。对照管上清液预先在沸水中加热3min灭活后再加入反应液。将反应管cAMP量减去对照管cAMP量即为白细胞AC催化ATP生成的cAMP量,用此量计算出AC的活性单位,以每20min每mg粗酶水解ATP所生成的cAMP pmol数表示。

1.7 胞质内游离钙浓度[Ca2+]测定:取各组白细胞悬液适量,用HBSS调整细胞数至1×10-9/L,各取2ml加入Fura-2/AM(终浓度为10μmol/L)孵育30min,然后按荧光比色法测定炎症白细胞[Ca2+]。

1.8 磷酸二酯酶(PDE)活性测定:参照酶放射化学分析法并加以改进。观察Tet在体内对炎症白细胞PDE活性的作用时,直接取各组白细胞悬液于4℃1800×g离心10min,去上清,加匀浆液(Tris 10mmol/L,EDTA 1mmol/L,pH7.4)将细胞数调整为1×10-9/L,在冰浴中超声破碎细胞4℃,1500×g离心,40min,取上清液50μl,依次加入测定缓冲液(含Tris 45mmol/L咪唑45mmol/L,醋酸镁5.5mmol/L)150 mmol/L和;3 nmol/L[3H]-cAMP 50μl,于37℃孵育15min后置沸水中3min终止反应,冷却后加入1%蛇毒15μl,再于37℃孵育15min加2.5mmol/L腺苷700μl,QAE-sephadex A-25柱层析分离,用20 mmol/L甲酸胺洗脱,取1ml洗脱液加7ml甲苯-Triton闪烁液,闪烁计数CPM值。PDE活性用每15min每mg粗酶水解[3H]-cAMP的fmol数表示。观察Tet在体外对炎症白细胞PDE活性的作用时,设以下实验组:①白细胞悬液+Tet 100μmol/L或等容量生理盐水;②白细胞悬液+Ca2+ 2.5mmol/L+Tet 100μmol/L或等容量生理盐水;③白细胞悬液+A23187  2μmol/L+Tet 100μmol/L或等容量生理盐水;④白细胞悬液+Ca2+ 2.5mmol/L+ A23187  2μmol/L+Tet 100μmol/L或等容量生理盐水;⑤白细胞悬液+Tet 100μmol/L+ A23187  2μmol/L+Ca2+(7.5/10mmol/L)。以上实验组各取Car致炎组白细胞悬液1ml(1×10-9/L),加入相应药物和试剂,37℃孵育30min后同上法测定PDE活性。

1.9 数据处理:所得数据采用SPSS程序进行单因素方差分析,实验结果用x平均±s表示,并对体内实验资料进行相关分析。

2 结果

2.1 Tet在体内对炎症渗出和炎症白细胞cAMP的作用,CAR致炎8h,胸膜腔渗出液量和胸膜腔炎症白细胞游出数较NS对照组增加,白细胞cAMP含量较NS对照组降低。Tet 10、20、40和80mg/kg腹腔注射,分别使胸膜腔渗出液量较CAR致炎组减少14.3%、28.6%、35.7%和46.4%;分别使胸膜腔炎症白细胞游出数较CAR致炎组减少25.8%、38/7%、48.4%和61.3%;但分别使炎症白细胞cAMP浓度较CAR致炎组增加1.6、2.2、2.8和3.2倍(Tab 1)。相关分析表明,Tet抑制胸膜腔液体渗出和白细胞游走的作用与其增加炎症白细胞cAMP浓度的作用之间存在线性相关关系(Fig 1)。

2.2 Tet在体内对炎症白细胞AC和PDE活性及[Ca2+]的作用

CAR致炎后8h,炎症白细胞AC活性较NS对照组增加1.5倍。PDE活性和[Ca2+]则分别增加5.3和2.4倍。Tet 10、20、40和80mg/kg腹腔注射剂量依赖地降低炎症白细胞PDE活性和[Ca2+],但对AC活性无明显影响(Tab 2)。相关分析表明,Tet增加炎症白细胞cAMP浓度的作用与其降低PDE活性的作用呈线性相关。Tet降低PDE活性的作用则与其降低[Ca2+]的作用呈线性相关(Fig 1)。

2.3 Tet在体外对炎症白细胞PDE活性的影响及与Ca2+、A23187的关系

在不含Ca2+、A23187的反应体系中,炎症白细胞PDE的活性定义为基础活性。在含Ca2+及A23187的反应体系中,PDE的活性定义为刺激活性。Tet 100μmol/L与炎症白细胞在37℃孵育30min对PDE基础活性无明显影响;Ca2+ 2.5mmol/L或A23187 2μmol/L单独与炎症白细胞孵育对PDE活性亦无明显影响;Tet 100μmol/L和Ca2+ 2.5mmol/L或A23187 2μmol/L与炎症白细胞孵育对其PDE活性仍无明显影响,但当Ca2+ 2.5mmol/L和A23187 2μmol/L同时与炎症白细胞孵育时,则可明显升高PDE活性;Tet 100μmol/L可明显抑制Ca2+ 2.5mmol/L和A23187 2μmol/L结合引起的炎症白细胞PDE活性升高,且Tet的抑制作用随细胞外Ca2+浓度增加而逐渐减弱(Fig 3)。

3 讨论

3.1 炎症时白细胞AC-cAMP-PDE系统的变化

本实验证实,大鼠角叉菜胶性胸膜炎时,炎症白细胞AC-cAMP-PDE系统发生明显的改变:AC活性增加1.5倍,cAMP浓度减少4.0倍,PDE活性增加5.3倍,AC活性升高可能主要是由于炎症反应引起肾上腺素能受体系统激活。PDE活性增加可能主要与炎症白细胞胞质内游离钙浓度增加有关。首先,PDE活性依赖于细胞内游离钙浓度。缺钙时,钙调素没有活性,当刺激引起胞质内游离钙增加时,钙调素与钙结合形成有活性的复合物,后者与细胞内PDE发生可逆反应,从而激活PDE。本实验观察到,在体外Ca2+ 2.5mmol/L或A23187 2μmol/L单独与炎症白细胞孵育对PDE活性无明显影响,但当二者同时与炎症白细胞孵育时则可明显升高PDE活性。这进一步支持细胞内钙离子浓度的增加可引起PDE激活。其次,本实验及以往研究均证实角叉菜胶性胸膜炎时炎症白细胞胞质内游离钙浓度明显增加,这可能是由于致炎因子的作用引起细胞外钙通过细胞膜上的钙通道进入细胞内、细胞内钙库释放钙和钙泵转运功能低下所致。cAMP由AC催化ATP水解生成,又被PDE降解为5-AMP,故cAMP浓度受AC和PDE活性的双重调节。在本实验中,由于PDE活性的增加明显大于AC活性的增加,故而cAMP浓度明显降低。

3.2 Tet的抗炎作用与其影响AC-cAMP-PDE系统的关系

本实验发现Tet在大鼠体内用药能剂量依赖地增加白细胞内cAMP浓度,Tet抑制胸膜腔液体渗出和白细胞游走的作用与其增加炎症白细胞cAMP浓度存在线性相关关系,这种相关关系可从cAMP能有效地抑制炎症介质和角叉菜胶所致的血管通透性增高得到解释。这提示增加炎症白细胞cAMP浓度可能是Tet的重要抗炎作用机制之一。如前所述,由于cAMP浓度受AC和PDE活性的双重调节,因此本实验研究了腹腔注射Tet对大鼠胸膜炎炎症白细胞AC和PDE活性的作用。研究表明,Tet腹腔注射呈剂量依赖性地降低炎症白细胞PDE活性,但对AC活性无明显影响。此外Tet增加炎症白细胞cAMP浓度的作用与其降低PDE活性的作用呈线性相关。因此,可以认为Tet可能主要通过降低PDE活性,减少cAMP降解,从而增加炎症白细胞cAMP浓度。

那么,Tet是如何降低炎症白细胞PDE活性的呢?由于PDE的激活依赖于钙离子的存在,而Tet为钙通道阻断剂,故而我们进一步研究了Tet降低炎症白细胞PDE活性的作用与其影响炎症白细胞胞质内游离钙浓度的关系。实验证实,Tet腹腔注射呈剂量依赖地降低炎症白细胞胞质内游离钙浓度,此作用与其降低炎症白细胞PDE活性之间存在呈线性相关关系,体外实验则观察到Tet单独与炎症白细胞孵育对PDE活性无明显影响,Tet和Ca2+或A23187与炎症白细胞孵育对PDE活性亦无明显影响,但Tet可明显抑制Ca2+和A23187结合引起的炎症白细胞PDE活性升高,而且Tet的抑制作用随细胞外Ca2+浓度增加而逐渐减弱。这些结果提示,Tet主要通过降低炎症白细胞胞质内游离钙浓度抑制PDE活性。

综上所述,Tet主要通过降低炎症白细胞[Ca2+]从而抑制PDE活性,进而增加cAMP浓度,这可能是Tet重要的抗炎作用机制之一。

3.3 Tet抑制PLA2活性与增加cAMP浓度的关系

以往的研究报道,Tet的抗炎作用与其抑制炎症白细胞磷脂酶A2激活和释放有关,这与本文的结论(增加炎症白细胞cAMP浓度可能是Tet抗炎作用的主要机制之一)是联系和统一的。一方面,Tet增加炎症白细胞cAMP浓度和抑制炎症白细胞磷脂酶A2激活和释放均导致炎症介质的释放减少,且二者均与Tet降低炎症白细胞胞质内游离钙浓度有关。另一方面,正常情况下,机体内抗炎系统和致炎系统处于平衡状态,当机体受到致炎因子的侵袭时两系统失去平衡,机体发生炎症,给大鼠胸膜腔注射致炎剂角叉菜胶后炎症白细胞cAMP浓度降低,而磷脂酶A2被激活和释放,胸膜腔有大量液体和白细胞渗出;于致炎前腹腔注射或灌胃使用Tet则分别增加炎症白细胞cAMP浓度和抑制炎症白细胞磷脂酶A2激活和释放,胸膜腔渗出液和白细胞数明显减少。因此,cAMP和磷脂酶A2可以视为存在于机体白细胞的一对抗炎与致炎系统,Tet体内用药增加炎症白细胞cAMP浓度与抑制炎症白细胞磷脂酶A2激活和释放,体现了其通过调节机体抗炎与致炎系统的平衡而发挥抗炎作用。

参考文献:略

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